屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水的代谢作用（一）

黄浆水是屎肠豆腐加工过程中的副产物，富含大豆异黄酮、球菌蛋白质和维生素P、发腐黄K等营养物质，酵豆浆水以及大量水溶性的谢作糖类，如水苏糖、屎肠棉籽糖、球菌蔗糖等，发腐黄通常被直接排放，酵豆浆水既浪费资源又污染环境。谢作黄浆水在贮藏的屎肠过程中可自然发酵为酸浆，是球菌一种良好的豆腐凝固剂。与石膏、发腐黄卤水作为凝固剂的酵豆浆水豆腐相比，酸浆豆腐质地细腻、谢作口感鲜嫩，深受人们喜爱。然而，自然发酵酸浆中含有大量的乳酸菌、酵母及其它微生物，也包括一些有害微生物，如蜡样芽孢杆菌，造成酸浆质量不稳定，并对酸浆豆腐的安全性构成威胁，从而限制了其工业化应用。

由于乳酸菌在酸浆形成过程中起主导作用，因此纯种乳酸菌发酵制备酸浆成为趋势。目前已有干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、解淀粉乳杆菌等多种乳酸菌应用于黄浆水发酵中。由于人体不能产生α-半乳糖苷酶，因此黄浆水中的主要低聚糖—水苏糖和棉籽糖等不能被人体消化利用，在肠道中被细菌发酵产气，导致胃肠胀气。研究表明有些乳酸菌，如鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌等具有α-半乳糖苷酶活性，在发酵的过程中可利用大豆低聚糖缓解胀气。另外，在乳酸菌发酵黄浆水的过程中，在β-葡萄糖苷酶的作用下，糖苷形式的大豆异黄酮可以转化为更易吸收的游离型苷元大豆异黄酮，从而提高发酵黄浆水的抗氧化活性。

屎肠球菌（Enterococcusfaecium）属于乳酸菌的一种，是肠道内的正常菌群，广泛存在于传统乳制品、泡菜、豆酱等发酵食品中，具有耐酸、耐热、肠道黏附能力强等特点，以及抑制病原菌、增强免疫力等作用。课题组前期从泡菜中筛选出1株屎肠球菌E.faeciumR2，该菌株可利用豆腐黄浆水中的低聚糖生长产酸，无需补充碳源和其它营养素即可达到豆腐凝固剂所需的酸度。采用该菌种纯种发酵制备酸浆可有效降低大肠杆菌等的污染，既解决了自然发酵酸浆中微生物杂乱的问题，提高了酸浆豆腐的安全性，又可降低生产成本，具有广泛的应用前景。为了更好地了解屎肠球菌R2对豆腐黄浆水的发酵特性，本研究采用HPLC法对屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水过程中的低聚糖、有机酸以及大豆异黄酮的组分和含量进行测定与分析，监控发酵过程中α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性的变化规律，并对发酵黄浆水的体外抗氧化活性进行评价，揭示屎肠球菌R2的发酵功能特性，以期为屎肠球菌R2的工业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

屎肠球菌E.faeciumR2，CGMCCNo.14944（专利保藏菌种），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，由淮南师范学院食品质量与安全实验室提供；食品级黄豆购于淮南苏果超市；黄浆水，实验室自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Ｔrolox、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、黄豆黄素、大豆黄素苷、草酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、果糖、葡萄糖、棉籽糖、水苏糖、蔗糖等标准品，美国Sigma公司；乙睛（色谱纯）、乙酸（色谱纯），天津科密欧化化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯），永华化学科技（江苏）有限公司；对硝基苯酚、4-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷、4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，阿拉丁生化科技股份有限公司；其它试剂均为国产分析纯。MRS液体培养基：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，无水乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-801mL，121℃灭菌15min，冷却备用。黄浆水培养基：将100mL黄浆水加入到250mL锥形瓶中，密封后121℃灭菌15min，冷却备用。

1.2 仪器与设备

SW-CＪ-2D型超净工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-250-A生化培养箱，广东泰宏君科学仪器股份有限公司；LDZW-60KCS-ll型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械；Ｔ6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；5804R型离心机，Eppendorf公司；KQ-400B型超声波清洗机，昆山超声仪器有限公司；HPLC2998高效液相色谱，Waters公司；250mm×4.6mm5μm氨基柱、250mm×4.6mm5μmＴhermoC18柱，Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 黄浆水的制备

以传统工艺制作的卤水黄浆水作为初级黄浆水，初级黄浆水接种屎肠球菌发酵剂（接种量3%）发酵36h制得一代酸浆。以一代酸浆做为凝固剂制得二级豆腐黄浆水，再接种屎肠球菌发酵剂（接种量3%）发酵36h制得二代酸浆。以二代酸浆做凝固剂制得三级豆腐黄浆水，如此循环三代后消除原卤盐凝固剂的影响，试验采用三代以后酸浆点制豆腐过程中所产生的黄浆水。

1.3.2 样品制备

将活化后的屎肠球菌R2按3%接种量接入新鲜豆腐黄浆水培养基中，于37℃下静置培养，获得发酵0，12，24，36h的样品，测定发酵过程中的屎肠球菌R2生物量和pH的变化趋势。样品经0.45μm微孔滤膜过滤后供后续分析使用。

1.3.3 HPLC测定大豆低聚糖

色谱柱：Aglient氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：70%乙腈-30%水（蔗糖、果糖、葡萄糖），68%乙腈-32%水（棉籽糖、水苏糖）；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：35℃；检测器：示差折光检测器。大豆低聚糖的标准曲线见表1。

1.3.4 HPLC测定有机酸

色谱柱：AgilentZORBAXSB-Aq（250mm×4.6mm，5μm）；ＴhermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：10mmol/L磷酸氢二钾（用磷酸调pH为2.55）；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。检测器：紫外检测器；波长：210nm。有机酸的标准曲线见表2。

1.3.5 HPLC测定大豆异黄酮

色谱柱：ＴhermoC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A：0.1%乙酸乙腈溶液，B：0.1%乙酸溶液；流速：1.0mL/min，柱温：30℃；进样量：10μL。检测器：紫外检测器；波长：260nm。梯度洗脱条件按照GB/Ｔ26625-2011。大豆异黄酮标准曲线见表3。

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